小小肽|海参多肽的研究进展
摘 要: 海参多肽是以新鲜海参为原料 ，经过卵白酶酶解 ，疏散纯化获得的具有功效特性的生物活性物质 ，研究发明海参多肽具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。本文综述了差别种类的海参多肽的生物活性、制备与精制要领以及结构鉴定等方面的研究进展。
要害词: 海参多肽 ，生物活性 ，精制 ，结构鉴定
海参( sea cucumber ，Ludwigothurea grisea) 属棘皮动物门、海参纲动物 ，凭据海参的外部特征 ，将其分为四个目九个科( 枝手目: 瓜参科、沙鸡子科、高球参科; 楣手目: 辛那参科、海参科、刺参科; 芋参目: 芋参科; 无足目: 锚海参科、指参科) 。全世界约有1100种海参 ，其中40种可食用 ，我国有100多种 ，其中20多种可食用［1］。干制的海参卵白质的身分很高 ，接近90% ，多糖6%左右 ，脂质约占 4% ，含有少量核酸以及钙、镁、铁、锰、锌、铜、钼、硒等微量元素［2］。差别种类的海参由于生长情况的差别 ，其营养价值和生物活性也有所差别 ，其中以刺参营养价值最高 ，属于海参中的精品 ，被称为“参中之冠”［2］。自古以来 ，海参作为营养食品和保健食品被广泛使用 ，海参常被制成海参干粉、海参熟制品、海参罐头等 ，大宗的应用是把海参作为食品原料进行简单的初级加工。海参多肽是以新鲜海参为原料 ，经过卵白酶酶解 ，疏散纯化获得的具有功效特性的生物活性物质 ，研究发明海参多肽具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。本文主要对海参多肽的生物活性以及制备疏散纯化要领进行介绍 ，为海参多肽在食品、医药、保健品等行业的应用提供依据和思路。
1 海参多肽的生物活性
1.1 抗氧化活性
生物体内氧自由基(oxygen-derived free adicals.OFR) ，主要包括超氧阴离子( O2-·) 、羟自由基(·OH)、羟过氧自由基( HOO·)、有机过氧自由基( ROOy)等 ，在生物体内不绝爆发 ，也不绝地被剖析 ，处于动态平衡之中 ，维持在一个正常的生理水平上。若体内自由基过量 ，可损伤体内的卵白质、核酸和生物膜 ，引起种种疾病。而自由基清除剂可清除体内自由基 ，�；せ迕馐苎趸鸷�。因此 ，近年来 ，对体内自由基清除剂的研究备受关注 ，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)、过氧化氢酶(catalase ，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (glutathione peroxidase ，GSH－PX )、抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione ，GSH)和维生素等［3］。
海参是一种高卵白低脂肪的食品 ，不但体腔液内GSH以及总抗氧化能力的含量高［4］ ，并且动物实验证明海参多肽可以提高机体内的抗氧化酶的酶活。侯付景等［5］通过小鼠喂养实验标明东海乌参(Acaudina leucoprocta)水解液使小鼠血清和肝脏组织中的SOD、GSH-PX 活力明显提高 ，MDA(丙二醛)含量显著降低 ，有效清除体内聚集的自由基。有关研究标明 ，海参多肽抗氧化性的强弱主要与多肽的氨基酸组成、氨基酸序列以及空间构象有关［6］。而目前研究主要集中在差别海参多肽的抗氧化能力与多肽分子量和浓度之间的关系 ，赵玲等［7］测定比较了大西洋海参(Holothuria coluber Semper)、东海海参(Acaudina mobpadioides Semper)、刺参( Apostichopus japonicus)和加州拟刺参( Parastichopus californicus)这4种海参多肽的抗氧化活性 ，其结果显示大西洋海参多肽、刺参多肽和加州拟刺参多肽划分对·OH、DPPH·(1 ，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)和O2-·的清除能力最强。不但新鲜海参多肽具有良好的抗氧化能力 ，有研究标明带有内脏的干制海参制备的多肽具有更高的抗氧化能力［8］ ，并且差别浓度海参多肽抗氧化能力也差别。苏永昌等［9］的研究标明随着海地瓜(Acaudina molpadioides) 多肽浓度的增加 ，多肽对羟自由基的清除能力迅速上升 ，当多肽浓度大于 20mg /mL ，多肽清除羟自由基能力则体现为平缓的上升趋势 ，其清除羟自由基和超氧自由基的IC50( half maximal inhibitory concentration of a substance ，半抑制浓度)划分为12.5、23.6mg /mL。别的 ，王静等［10］还发明差别分子量海参(Apostichopus japonicus)多肽清除·OH、O2-·、H2O2的IC50也差别 ，其结果标明: 4种分子量规模的海参多肽清除3种氧自由基的能力保存差别 ，巨细顺序为CPHIV(<3ku)>CPHIII(3～5ku)> CPHII(5～10ku> CPHI(>10ku) ，分子量越小的海参多肽清除3种氧自由基的能力越大 ，4种分子量规模的海参多肽清除O2-·的效果最好 ，其次是H2O2 ，最后是·OH。
1.2 降血压活性
随着人们生活水平的不绝提高 ，高卵白、高脂肪的摄食越来越公共化 ，高血压的患病率也逐步上升。血管紧张素转换酶(Angiotension-Ⅰ-converting Enzyme ，ACE)是肾素-血管紧张素系统( Renin-Angiotensnisystme ，ARS)和激肽释放酶-激肽系统(Kal1ikrein-KininSystme ，KKS)的要害酶［11］ ，在ARS中 ，ACE将无升压活性的血管紧张素Ⅰ水解为具有升压活性的血管紧张素Ⅱ ，在KKS中 ，ACE使具有降压活性的缓激肽降解失去降血压活性。通过以上两个途径 ，ACE加入体内血压调理 ，造成血压的升高 ，引发高血压［12］。
海参多肽作为一种有效的ACE抑制剂 ，就是通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性从而抵达降低血压的目的的。有研究标明 ，分子量<2ku的海参多肽具有较强的ACE抑制活性 ，其中海地瓜体壁卵白水解物<2ku的多肽ACE抑制活性的IC50值达0.615mg /mL［13］。差别酶的酶活和作用位点的差别导致酶解产品的分子量漫衍差别 ，影响其ACE抑制活性。赵元晖等［14］比较了Ⅰ型胶原酶、胰卵白酶、木瓜卵白酶、菠萝卵白酶、3942中性酶、Alcalase 2.4L六种海地瓜卵白水解液ACE抑制活性的巨细 ，结果标明: 6种卵白酶水解液对ACE抑制效果从大到小依次为: 菠萝卵白酶水解液>Ⅰ 型胶原酶水解液>Alcalase酶水解液>3942中性酶水解液>木瓜卵白酶水解液>胰卵白酶水解液。Forghania［15］也比较了糙海参(Golden sea cucumber)六种差别酶酶解液的ACE抑制活性的巨细 ，发明碱性卵白酶酶解液具有最高的ACE抑制活性 ，IC50达0.41mg /mL ，其次为风味卵白酶 ，然后是菠萝卵白酶和木瓜卵白酶 ，最后为胰卵白酶和复合卵白酶。海地瓜酶解物经过类卵白反应(类卵白反应是指利用浓缩的卵白质在合适的条件下经卵白酶的作用合成的类卵白产品)修饰后 ，ACE抑制活性能够明显升高［16］。ACE抑制活性的巨细主要与其ACE抑制肽的C-末端氨基酸序列有关 ，其中主要与三肽序列有关 ，Monti等［17］ 研究证实 ，ACE抑制肽的C-末端三肽序列含疏水性氨基酸(芳香族氨基酸或带支链氨基酸) ，活性较强 ，若其中C-末端三肽序列中含有一个脯氨酸或者含有一个带正电的氨基酸如赖氨酸(ε-氨基带正电荷)、精氨酸(胍基带正电荷) ，其活性也会明显增强。
1.3 其他生物活性
海参多肽除具有抗氧化和降血压活性之外 ，还具有降血脂、抗疲劳、抗癌以及镇痛等生物活性。Rodriguez等［18-19］将从海参(Holothuria forskali)酶解液中提取的多肽喂养大鼠 ，检测其对大鼠血脂的影响 ，结果显示海参多肽在明显升高血清高密度脂卵白的含量的同时降低血清甘油三酯的的水平 ，从而抵达降血脂的效果。王海涛等［20］研究结果发明刺参(Apostichopus japonicus)多肽具有比较好的抗疲劳的效果 ，其作用机理主要为能够显著降低运动后小鼠的血尿素氮含量以及提高其肝糖原含量 ，且功效随着灌胃剂量的提高而增强。付学军［21］进一步研究了差别浓度的低分子量的海参肽对小鼠抗疲劳的作用 ，结果发明低分子量的海参肽对小鼠的体重没有明显的影响 ，具有显著的抗疲劳作用。王奇等［22］也验证了海参的抗疲劳活性 ，通过动物实验还发明东海海参多肽能够提高小鼠的影象力 ，其作用机制可能是上调小鼠内影象相关基因转录水平的表达。卢连华［23］和谢永玲［24］研究了海参肽对小鼠的免疫调理功效的影响 ，结果标明海参肽能够增强小鼠体液免疫功效、非特异性免疫功效以及自然杀伤(HK)细胞。王奕［25］通过动物实验研究日本刺参(Apostichopus japonicus)多肽的抗肿瘤作用 ，结果标明差别剂量组的日本刺参胶原卵白多肽均能够显著抑制小鼠S180肉瘤的生长。有研究还标明鲜海参的提取物对体外培养的人胃癌细胞栋(MGC)、人肝癌细胞株(7402)以及小鼠的乳腺肉瘤细胞栋(EMT6 )的生长有显著的抑制作用［26］。Shinichi等［27］还从日本刺参中疏散出一种五肽和七肽 ，其研究结果标明这两种小分子的多肽能够增进生殖细胞的形成和卵母细胞的成熟。除此之外 ，Ridzwan［28］利用动物实验证明玉足海参(Holothuria leucospilota)、图纹白尼参( Bohadschia marmorata)的水提取物、糙刺参(Stichopus hermanii)的腹腔液都具有良好的镇痛作用。海参多肽的多种生物活性正在逐渐被人们认识 ，大宗的动物实验证明了海参作为保健品和功效食品的潜力。
2 海参多肽的提取、精制以及结构鉴定
近年来 ，关于差别种类海参多肽的制取、精制已经有较多的报道 ，可是关于其活性结构的鉴定研究才刚刚开始。目前 ，海参多肽的制取常接纳酶解法 ，制备差别生活活性的海参多肽选择的酶也不尽相同 ，常接纳复合卵白酶和中性卵白酶; 精制主要围绕脱盐、脱色进行 ，常用活性炭或者大孔树脂物理吸附进行 脱 色 ，柱层析进行脱盐 ，制备高商品性状的产品。
2.1 海参多肽的制取
生物活性肽的生产要领主要包括从自然界中提取天然活性物质、卵白质降解以及化学合成法［29］。其中 ，在海参多肽的制取历程中 ，应用最成熟的技术为卵白质定向酶切 ，即利用差别的酶或者微生物对海参进行卵白质降解获得具有差别功效的生物活性多肽［30］。在酶解历程中 ，通过酶种类的选择 ，酶解条件的控制(加酶量、反应温度、反应时间、底物浓度)来获得具有特定生理功效的生物活性肽［31］。
向怡卉等［32］利用复合卵白酶水解海参生殖腺 ，制得水解度达50%的海参卵白液。水解度是权衡水解水平的一个重要指标 ，水解度越高 ，水解得越彻底 ，但多肽的含量纷歧定高。因此 ，为了获得更高含量的多肽 ，张彧等［33］选择多肽得率作为目标来控制海参的酶解 ，获得多肽的得率为42%左右的海参多肽。海参多肽的肽链中含有羟基、氨基和羧基等多种亲水基团 ，能够与水分子结合 ，是很好的吸湿剂 ，同时由于其分子量小 ，很容易被皮肤吸收 ，不但维持肌肤的吸水还具有良好的保湿效果 ，因此 ，其吸湿性和保湿性同样受到人们的关注 ，朱洪珍等［34］选择中性卵白酶对海地瓜进行酶解 ，获得吸湿率和保湿率划分为6.11%和81.23% 的海地瓜胶原卵白多肽。人们在研究选择合适的外加酶进行海参多肽的酶解的同时也在关注海参自身的酶对其酶解的影响。郑杰等［35］的研究进一步验证了海参肠内酶的作用 ，其研究标明 ，海参肠自溶水解物具有一定的DPPH· (1 ，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基)清除能力、Fe2 +螯合能力和还原能力。结合之前的研究以及实际生产的需要 ，王静等［36］将海参体内酶与外加酶结合使用 ，将完整的海参匀浆后诱导其自溶 ，以自溶后水解液为底物 ，加入复合卵白酶进行二次水解 ，从而提高酶解效率 ，二次水解后海参多肽的得率从34%提高到约为60%。
2.2 海参多肽的精制
海参多肽的精制历程一般包括预处理、疏散、纯化和纯度测定四个阶段 ，其中纯化是最为要害的阶段。利用酶解法制备海参多肽的历程中主要保存着盐含量过高、颜色过深等问题 ，因此海参多肽的纯化主要围绕着脱盐、脱色进行。在酶解历程中 ，凭据差别的酶的最适pH ，必须通过不绝的加酸或者碱来维持体系pH的稳定 ，因此水解物中含有一定量的盐分 ，这些盐分对海参多肽的理化性质、适用规模和生物活性爆发影响。目前常用的脱盐的要领有离子交换树脂法、透析法和超滤法。王静等［36］接纳透析法和超滤法对刺参多肽进行脱盐纯化 ，脱盐率抵达85%左右。海参体壁的大宗色素经过酶解沉积到海参多肽中 ，导致海参多肽颜色过深影响其开发利用 ，张翠玉等［37］研究了NKA-9、AB-8、D392、D280、D101、D315 六种差别的大孔树脂对海地瓜多肽的脱色效果。结果标明: 树脂D392可较好的用于海地瓜多肽的脱色 ，脱色率抵达83. 2% ，多肽保存率为80.5%。海参经过酶解获得多肽的分子量漫衍约莫为500～3000u ，分子量的差别对多肽的抗氧化性、ACE抑制活性等功效都有影响 ，疏散并纯化差别分子量规模的多肽对研究其生物活性具有重要意义 ，目前常用的纯化要领主要有: 柱层析、高效液相色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。赵元晖等［14］利用Sephadex G-25凝胶柱层析、SP Sephadex C-25阳离子交换层析、反相高效液相色谱层析对海地瓜复合酶水解产品进行疏散纯化 ，获得两种高活性、高纯度的ACE抑制肽。王洪涛等［38］将海参酶解液先经过醇沉、离心疏散海参多肽和卵白 ，再对海参卵白和多糖划分进行纯化 ，获得较高纯度的海参多肽和多糖 ，使得海参的营养价值获得更好地应用。
2.3 海参多肽的结构鉴定
迄今为止 ，海内外的学者主要对海参中的一些活性身分好比海参多糖的提取、疏散纯化以及结构鉴定进行了较多的报道 ，可是关于海参多肽的结构组成的研究比较少。有研究标明 ，海洋多肽的生物活性与多肽的氨基酸序列、多肽的结构、疏水性以及所带的电荷有关［39］ ，因此测定海参多肽的结构为我们更好的研究海参生物活性提供基础。目前外洋学者对氨基酸序列的测定做了大宗的事情 ， Birenhenide［40］从海参中疏散出两种多肽 ，一种为Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg ，另一种为 Pro-Leu-Gly-Tyr-Met-Phe-Arg ，属于神经肽类 ，主要影响海参真皮的硬度及弹性。Miranda［41］从海参(Holothuria glaberrima)中疏散出两种肽 ，一种为Gly-Phe-Ser-Lys-Leu-Tyr-Phe-NH2 ，命名为GFSKLYFamide ，另一种为Ser-Gly-Tyr-Ser-Vak-Leu-Tyr-Phe-NH2 ，命名为SGYSVLYFamide ，其中GFSKLYFamide对海参神经肌肉的结缔组织有重要影响。Sunil Kumar 等［42］从海参(Caudina Arenicola)中疏散出一种四肽 ，经测定得出其结构为Pro-Glu-Leu-Leu ，是C球卵白的94-97片断。我国学者Liu Zunying等［43］从巨型红海参(Parastichopus californicus)中提取胃卵白酶可溶性胶原卵白属于Ⅰ型胶原卵白 ，但在氨基酸组成与Ⅰ型胶原卵白有一些差别。赵元晖等［14］应用纳升电喷雾四极杆-航行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/ Ms)技术 ，对从海地瓜中疏散获得的ACE抑制肽 P1、P2进行结构鉴定。P1的精确分子量为1629.7u ，氨基酸序列为YYLEMDFLLFNY; P2的精确分子量为1034.5u ，氨基酸序列为MEGAQEAQGD。可是海参多肽的氨基酸序列和结构对其生物活性的具体影响机制还需要进一步的研究。
3 展望
近年来 ，海参多肽的研究取得了较大的进展 ，但和某些功效性多肽的研究相比 ，还保存着一定的差别。关于差别种类海参多肽的提取条件的优化、疏散纯化和生物活性等方面的研究已较为成熟 ，而其结构测定和构效关系的研究却很是有限。目前 ，虽然人们对海参多肽的生理功效做了大宗的研究 ，但是大部分研究比较浅显 ，对具体的作用历程和作用机制了解的不敷详细。别的 ，海参种类繁多 ，目前的研究也大部分局限在一些价格比较腾贵的海参品种上 ，好比刺参、糙参 ，另有其它品种的海参需要进行进一步的开发和利用。
今后 ，对海参多肽的研究主要着重于以下几个方面:
差别海参多肽的结构测定: 从目前的研究来看 ，由于海参的种类繁多 ，差别种类海参多肽的结构差别 ，差别水解水平获得的差别分子量的多肽的结构也差别 ，从而增加了海参多肽结构测定的难度。可是海参多肽的结构是其生理功效的基础 ，更深入的事情有待于进一步开展。
海参多肽的修饰与构效关系的研究: 多肽的修饰可能导致其生物活性爆发变革 ，好比多肽的修饰可以使活性低或者不具有活性的海参多肽具有较高的活性 ，因此对其构效关系的研究有助于海参多肽以及其衍生物的制备。
海参多肽生物活性的作用机制的研究: 目前对于海参多肽的生物活性的研究的文章较多 ，但只通过实验报道了结果以及可能的作用机制。关于海参多肽作用机制的更全面系统的报道需要进一步的探讨。
应用研究: 进一步开发其它种类的海参多肽 ，研究海参多肽的功效性身分的高效制取和疏散纯化 ，实现海参多肽的大规模生产 ，并应用于食品和医药制品中 ，发挥其越发重要的作用。
